수질 물벼룩을 이용한 급성독성(생태독성) 시험법

수질오염공정시험기준(ES 04704.1a)

수질 물벼룩을 이용한 급성독성 시험법

1.0 개요

1.1 목적

이 시험기준은 수서무척추동물인 물벼룩을 이용하여 시료의 급성독성을 평가하는 방법으로써 시료를 여러 비율로 희석한 시험수에 물벼룩을 투입하고 24시간 후 유영상태를 관찰하여 시료농도와 치사 혹은 유영저해를 보이는 물벼룩 마리수와의 상관관계를 통해 생태독성값을 산출하는 방법이다.

 

1.2 적용범위

이 시험기준은 산업폐수, 하수, 하천수, 호소수 등에 적용할 수 있다.

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4.0 시약

 

4.1 배양액 및 희석수

4.1.1 시험생물을 배양하기위해 제조된 용액을 ‘배양액’이라하고, 독성시험을 할 때 원수를 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %로 희석하기 위한 용액을 ‘희석수’라 한다.

 

4.1.2 독성시험에 사용하는 희석수는 배양액과 동일한 것을 사용하고 표 1과 같은 조성으로 제조한다.

4.1.3 배양액 또는 희석수의 pH는 7.6 ∼ 8.0, 경도는 160 mg CaCO3/L ∼ 180 mg CaCO3/L, 알카리도는 110 mg CaCO3/L ∼ 120 mg CaCO3/L, 용존산소는 3.0 mg/L 이상 유지되도록 하며, 사용하기 전 24시간 정도 폭기시킨다.

 

4.2 시험생물

4.2.1 시험생물은 물벼룩인 Daphnia magna straus를 사용하도록 하며, 출처가 명확하고 건강한 개체를 사용한다.

 

4.2.2 시험을 실시할 때는 계대배양(여러 세대를 거쳐 배양)한 생후 2주 이상의 물벼룩 암컷 성체를 시험 전날에 새롭게 준비한 용기에 옮기고, 그 다음날까지 생산한 생후 24시간 미만의 어린 개체를 사용한다. 물벼룩은 배양 상태가 좋을 때 7일 ∼ 10일 사이에 첫 새끼를 부화하게 되는데 이때 부화된 새끼는 시험에 사용하지 않고 같은 어미가 약 네 번째 부화한 새끼부터 시험에 사용하여야 한다. 군집배양의 경우, 부화 횟수를 정확히 아는 것이 어렵기 때문에 생후 약 2주 이상의 어미에서 생산된 새끼를 시험에 사용하면 된다.

 

4.2.3 외부기관에서 새로 분양 받았다면 4.2.2의 방법과 동일한 방법으로 계대배양하여, 2번 이상의 세대교체 후 물벼룩을 시험에 사용해야 한다.

 

4.2.4 시험하기 2시간 전에 먹이를 충분히 공급하여 시험 중 먹이가 주는 영향을 최소화하도록 한다.

 

4.2.5 먹이는 Chlorella sp., Pseudochirknella subcapitata등과 같은 단세포 녹조류를 사용하고 보조먹이로 YCT (yeast, chlorophyll, trout chow)를 첨가하여 사용할 수 있다.

 

4.2.6 물벼룩을 폐기할 경우에는 망으로 걸러 살아있는 상태로 하수구에 유입되지 않도록 주의해야한다.

 

4.2.7 배양액을 교체해주거나 정해진 희석배율의 시험수에 시험생물을 옮겨 주입할 때에는 시험생물이 공기 중에 노출되는 시간을 가능한 한 짧게 한다.

 

4.2.8 태어난 지 24시간 이내의 시험생물일지라도 가능한 한 크기가 동일한 시험생물을 시험에 사용한다.

 

4.2.9 평상시 물벼룩 배양에서 하루에 배양 용기 내 전체 물벼룩 수의 10 % 이상이 치사한 경우 이들로부터 생산된 어린 물벼룩은 시험생물로 사용하지 않는다.

 

4.2.10 배양시 물벼룩이 표면에 뜨지 않아야 하고, 표면에 뜰 경우 시험에 사용하지 않는다.

 

4.2.11 물벼룩을 옮길 때 사용되는 스포이드에 의한 교차 오염이 발생하지 않도록 주의를 기울인다.

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7.0 분석절차

 

7.1 시료의 희석비는 원수 100 %를 기준으로, 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 %로 하여 시험한다.

 

7.2 한 농도 당 시험생물 5마리씩 4개의 반복구를 둔다. 이때, 시험용액의 양은 50 mL로 한다.

 

7.3 시험기간 동안 조명은 명 : 암 = 16 : 8시간을 유지하도록 하고 물교환, 먹이공급, 폭기를 하지 않는다.

 

7.4 시험 온도는 (20 ± 2) ℃ 범위로 유지 되어야 한다.

 

7.5 24시간 후의 유영저해 및 치사여부를 관찰하여 그 결과로 원수 및 각 희석수의 EC50을 구한다.

 

7.6 원수 및 각 희석수의 EC50을 통계프로그램인 프로빗 (Probit)방법 또는 트림드 스피어만-카버 (Trimmed Spearman-Karber)방법을 사용하여, 최종적으로 시료의 EC50값과 95 %에서의 신뢰 구간을 구한다.

[주 4] 프로빗방법은 1 % ∼ 99 % 사이에 유영저해 및 사망에 대한 데이터가 2개 이상인 경우 이용 가능하고, 트림드 스피어만-카버는 유영저해 및 사망률 자료가 1개 이상인 경우에 이용 가능하다.

 

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8.0 결과보고

 

8.1 생태독성값 계산

8.1.1 통계적 방법을 통한 EC50을 구할 수 있는 경우

 

생태독성값 (TU)= 100/EC50 

8.1.2 통계적 방법을 통한 EC50을 구할 수 없는 경우

8.1.2.1 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 0 % ∼ 10 %에 영향이 있는 경우(예: 원수인 100 % 시료에 투입 물벼룩 20마리 중 0마리 ∼ 2마리가 유영저해 및 치사를 보일 때)에는 TU를 0으로 한다.

 

8.1.2.2 원수 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 10 % ∼ 49 %에 영향이 있는 경우에는 0.02 × (유영저해율 또는 치사율)로 TU를 계산한다.

[주 5] 원수인 100 % 시료에 투입 물벼룩 20마리 중 5마리가 유영저해 및 치사가 관찰되었을 때, 0.02 × 25 = TU 0.5 가 된다

 

8.1.2.3 원수 100 % 시료에서 투입 물벼룩의 51 % ∼ 99 %에 영향이 있는 경우, 1 < TU < 2로 표시하거나, 필요에 따라 100 %, 75 %, 35 %, 12.5 %로 시험수의 농도를 조절하여 다시 시험한다.

 

8.2 시험 결과 보고

8.2.1 시험결과는 소수 첫째자리까지 표기하고 수치의 맺음법은 ES 04000b 총칙 5.0 시험결과의 표시검토에 따른다.

[주 6] 원수와 방류수에 대한 결과기록부는 부록의 별지 1과 별지 2의 서식에 따라 작성하여야 한다.

 

8.2.2 시험결과 보고시 시료농도별 물벼룩 개체수 와 누적유영저해 개체수, 대조군에서의 치사율, 기타 시험과정에서 관찰된 이상 현상 및 내부정도관리차트를 반드시 함께 보고하여야 한다.